那么區(qū)分HPLC、UHPLC、UPLC的關鍵點就是分離性能。

1、技術原理不同 

（1）UPLC的原理：借助于HPLC（高效液相色譜）的理論及原理，涵蓋了小顆粒填料、非常低系統(tǒng)體積及快速檢測手段等全新技術，增加了分析的通量、靈敏度及色譜峰容量。

（2）HPLC的原理：以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。
2、特點不同

（1）與傳統(tǒng)的HPLC相比，UPLC的速度、靈敏度及分離度分別是HPLC的9倍、3倍及1.7倍，它縮短了分析時間，同時減少了溶劑用量降低了分析成本。不過由于實驗過程中儀器內部壓力過大，也會產生相對應的問題。例如泵的使用壽命會相對降低，儀器的連接部位老化速度加快，包括單向閥等部位零件容易出現(xiàn)問題等。
（2）而HPLC，流動相為液體，流經(jīng)色譜柱時，受到的阻力較大，為了能迅速通過色譜柱，必須對載液加高壓；分析速度快、載液流速快，較經(jīng)典液體色譜法速度快得多，通常分析一個樣品在15～30分鐘，有些樣品甚至在5分鐘內即可完成，一般小于1小時；分離效能高，可選擇固定相和流動相以達到最佳分離效果，比工業(yè)精餾塔和氣相色譜的分離效能高出許多倍；靈敏度高，紫外檢測器可達0.01ng，進樣量在μL數(shù)量級；應用范圍廣，百分之七十以上的有機化合物可用高效液相色譜分析，特別是高沸點、大分子、強極性、熱穩(wěn)定性差化合物的分離分析，顯示出優(yōu)勢。

最主要的部分是色譜柱的粒徑。

HPLC如最常見的C18柱（5um，4.6mm * 250mm）， 超高效液相色譜柱相對更小，如3.5um 3.0um，甚至更小，2.0um。由于粒徑小，固定相的表面積變大。例如，一個5um的支柱就像一條充滿石頭的河流，一條2.0um的支柱是一條充滿細沙的河流。通過這種方式，樣品分離得更快，節(jié)省了大量的流動相和時間。但儀器上的壓力會更高。
因此，超高效液相色譜（UHPC）的主要改進是提高其泵效率和組件耐壓性。如果將小柱置于正常液相中，則確定柱壓力將超過壓力上限并且界面將泄漏。如果高效液相色譜（HPLC）充分利用這種小粒徑色譜柱，則可以節(jié)省成本并獲得更好的結果。

用文字總結為三大標準：

HPLC高效液相色譜：擴散體積>30μL，最高耐壓<6,000 PSI的液相色譜系統(tǒng)，最適宜色譜柱粒徑是5µm；

UHPLC超高效液相色譜：擴散體積15-30 µL，最高耐壓≥9,000 PSI的液相色譜系統(tǒng)，最適宜色譜柱是粒徑粒2-3.5μm的實心核顆粒色譜柱；

UPLC：擴散體積<15 µL，最高耐壓≥15,000 PSI的液相色譜系統(tǒng)，最適宜色譜柱粒徑是 <2µm。

至于上述各種類型色譜給用戶帶來的不同感受，大家可回顧和參考超高效液相色譜的好處：更高分離度、更高效率、更快速度、更省溶劑、更環(huán)保、更適合連接質譜等等。

1、溶液的制備很關鍵

在色譜系統(tǒng)中，溶液是一個更重要的部分，那么UPLC中溶液的制備應該是怎樣的呢？

樣品溶液的制備

樣品的制備同樣是過濾和離心兩種方法。

過濾：根據(jù)樣品溶液的極性，選擇不同材質的0.22um濾膜過濾。

濾膜的選擇，要進行分析方法確證，濾膜的相容性實驗。

*此處強調一下，必須是0.22um，千萬不要用錯。

離心：采用高速離心的方式（大于10000轉/分鐘）。

離心的方法一般適用于過濾較困難的溶液，為了保護UPLC的系統(tǒng)，離心完畢后建議再次進行過濾。

流動相的制備

所用有機相應是進口的色譜級別。使用的水應為超純水，MILLI-Q純水機生產的即可。

配制緩沖鹽溶液應該有效期的規(guī)定，根據(jù)各實驗室SOP規(guī)定。

所有的流動相用前必須使用0.22um的微孔濾膜過濾。

有很多同仁在平衡色譜柱時，因為使用的是甲醇/水或是乙腈/水系統(tǒng)，因為不涉及到緩沖鹽溶液，經(jīng)常把過濾這一步省略，再次提醒大家：

UPLC系統(tǒng)使用的所有流動相均必須經(jīng)過0.22um的微孔濾膜過濾。

2、色譜柱的使用

若柱效不佳，將會浪費樣品分析時間，問題排查時間，更是浪費寶貴樣品。所以色譜柱的使用操作的規(guī)范性，直接決定UPLC的分析效率與數(shù)據(jù)可靠性。

首先，應與色譜柱的供應商溝通，充分了解色譜柱的性能，如反相柱、正相柱、氰基柱、親水柱、離子交換柱等。

再次，建立色譜柱的管理SOP，在SOP中規(guī)定色譜柱的登記、啟用、使用及報廢記錄，便于色譜柱整個生命周期的管理。

色譜柱的啟用

色譜柱包裝開啟后一定要閱讀說明書，關注說明書中的注意事項，如pH的適用范圍、流動相中能否采用水、平衡時的流速，保留溶劑等。

對于正相色譜柱來說，最重點的時注意初始流速一定要小，一般0.2ml/min。

反相柱就比較麻煩一點了，先用小流速0.2ml/min的甲醇沖洗2小時，再用10%甲醇沖洗2小時，最后過渡到檢品的流動相，流速由低逐步增加到目標流速。

柱子開始使用前，必須確認系統(tǒng)適用性測試是否滿足要求，主要關注理論板數(shù)、分離度、拖尾因子等關鍵分離參數(shù)，驗收合格后才能使用。

色譜柱的清洗和保存

正相色譜柱進樣后一般無需刻意清洗，但是需要保存時，必須按照說明書要求選擇溶劑，以免長時間引起固定相干涸。反相色譜柱清洗過程：高水相等度洗脫保證緩沖鹽沖洗干凈后，梯度洗脫的方式過渡到純有機相，等度洗脫10~30柱體積，柱溫可適當提高2~5度，方法運行完及時關閉柱溫。

對于親水作用色譜柱：最后保存盡量避免使用純有機相，應包含少量的水，比如95%的乙腈。       

色譜柱的使用

使用色譜柱，應輕拿輕放，安裝零死體積。

切忌由大流速變化引起的壓力變化對色譜柱造成機械損傷，應使用逐漸提高流速的方法達到目標流速。

建立色譜柱的使用記錄，記錄中體現(xiàn)出理論板數(shù)、分離度拖尾因子、柱壓、保留時間、流動相體系、保存溶劑等信息，一旦發(fā)現(xiàn)參數(shù)異常，以便展開調查，避免偏差發(fā)生。

色譜柱使用過程中，應關注其柱壓、柱效，使用完畢后填寫“色譜使用記錄”。

色譜柱最好是專用，帶保護柱。并且使用過緩沖鹽的色譜柱最好不要用于新項目的方法開發(fā)。

低紫外區(qū)的檢測，為了避免“鬼峰”的出現(xiàn)，可以使用捕集柱，色譜柱使用完畢后一定要按SOP及時清洗。

對于鬼峰捕集柱的使用，很多科研單位覺得不可行，不知道如何在標準中進行表達。其實在方法建立過程中，如果鬼峰無法避免，可以在“發(fā)展報告”中說明使用鬼峰捕集柱的理由，并在標準中如實描述，以便與廠家或是QC進行方法轉移。

有關親水性色譜柱，小編也有些提議：

以HILIK色譜柱為例，使用更少或是較弱的極性溶劑可以增加極性化合物的保留。

樣品溶解的溶液盡可能接近流動相條件的初始條件，然而，極性大的分析物經(jīng)常在有機溶液中存在溶解度較低的現(xiàn)象，可以先用水溶解樣品，再用乙腈/水溶液進行稀釋，需要平衡溶解度和峰形之間的關系，根據(jù)化合物性質，具體情況具體分析。

色譜柱的報廢要素

1.色譜柱堵塞，壓力升高1000psi。

2.色譜柱污染出現(xiàn)鬼峰、噪音增加、檢測限增大時。

3.填料塌陷或污染引起色譜圖前沿、拖尾、分叉時。

4.理論板數(shù)、分離度、拖尾因子按各檢品質量標準規(guī)定執(zhí)行，未規(guī)定的按各國藥典通則規(guī)定執(zhí)行，不符合上述規(guī)定時。